Premio Internacional de Investigación sobre coagulopatías Congénitas, Duquesa de Soria 2019, al Dr. Antonio Liras Martín, miembro del Comité Medico de la Federación Española de Enfermedades Raras y Profesor en la Universidad Complutense de Madrid, por el proyecto titulado “Enfermedades raras. Circunstancias y desafíos. De la causa mutacional a la terapia génica del déficit de Factor V de la coagulación“.

AUTORES:
Antonio Liras. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense. Madrid, España.
Sara Bernal. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau y IIB Sant Pau, y CIBERER U-705. Barcelona, España.
Mariano García-Arranz. Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz, Instituto de Investigación Sanitaria FJD, IIS-FJD UAM. Madrid, España.
Luis Javier Serrano. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense. Madrid, España.
José Carlos Segovia. Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT), y CIBERER. Madrid, España.
Juan Andrés de Pablo. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense. Madrid, España.
Damián García-Olmo. Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz, Instituto de Investigación Sanitaria FJD, IIS-FJD UAM. Madrid, España.

RESUMEN
Las enfermedades raras, también denominadas huérfanas o poco frecuentes, son aquellas patologías cuya prevalencia en la población es muy baja, del orden de 1 por cada 2000 individuos. Cuando la prevalencia es de 1 por cada 50000 individuos se habla de enfermedades ultra raras. A pesar de la denominación de “raras”, estas enfermedades son muy numerosas en su conjunto y en su mayor parte están asociadas con alteraciones genéticas. Según el Consorcio Internacional de Enfermedades Raras y Orphanet, se han descrito unas 7000 enfermedades raras de las que tan solo del 60% se conoce su base genética. El 95% de ellas no dispone de un tratamiento específico y eficaz debido, en gran parte, al gran desequilibrio entre coste beneficio que supone para las empresas farmacéuticas en cuanto al desarrollo I+D+i. Este desequilibrio se hace aún más acusado en el caso de las enfermedades ultra raras.

El déficit de factor V, es una enfermedad genética autosómica recesiva, caracterizada por ser una enfermedad ultra rara debido a su incidencia en la población 1-9/1000000 nacidos vivos. Clínicamente, esta deficiencia se caracteriza por episodios de sangrado, que varían de leves a severos en función de los niveles del factor V en plasma. Estos episodios comienzan antes de los 6 años y están asociados con un espectro heterogéneo de manifestaciones hemorrágicas, que van desde sangrados en tejidos blandos o mucosas hasta hemorragias masivas fatales. Los signos clínicos de este déficit son: abundantes sangrados nasales (epistaxis) y menstruales (menorragias), sangrados durante cirugías mayores e incluso menores, como también durante procedimientos dentales, artropatías hemorrágicas (hemartrosis), hematomas y en los casos más severos sangrados gastrointestinales, pulmonares e intracraneales. En cuanto a las causas del déficit congénito de factor V, en la mayoría de los casos se debe a mutaciones, de diferente tipo, en el gen F5.

La mayoría de estas mutaciones son recesivas, lo que significa que para que se dé un fenotipo patológico los individuos han de ser homocigotos o heterocigotos compuestos. Como ocurre con las hemofilias, dependiendo de los niveles en plasma de factor V, se distinguen varios grados de severidad según la tendencia o riesgo de sangrados, así como la gravedad de los síntomas, dando lugar a una clasificación de tres niveles: leve (>10% de factor), moderada (1-10%) o severa (<1%).

El gen F5, en humanos, se localiza en el brazo largo, q23, del cromosoma 1 (1q23). Es un gen muy grande, formado por alrededor de 80 kb, constituido por 25 exones y 24 intrones, siendo el exón 13 el de mayor tamaño, suponiendo un 42% del tamaño total del conjunto de exones y siendo el menos conservado entre las distintas especies. Su RNA mensajero maduro tiene un tamaño de alrededor de 6,8 kb, el cual codifica para una proteína de aproximadamente 2224 aminoácidos que presenta 6 dominios en su forma inactiva, A1-A2-B-A3-C1-C2, constituyendo los dominios A1-A2 la cadena pesada, el domino B, codificado íntegramente por el exón 13, la región postraduccional y los dominios A3-C1-C2 la cadena ligera de la proteína. El tamaño de esta proteína inactiva es de alrededor de 330 kDa. Se trata de una proteína sintetizada principalmente en el hígado por los hepatocitos, en torno al 80%, y el 20% en los megacariocitos y plaquetas. Esta proteína, con una vida media de entre 12-36 horas, es secretada al torrente sanguíneo donde circula en mayor proporción libre en plasma, mientras que una pequeña parte es almacenada en los gránulos α de las plaquetas.

El diagnóstico del déficit de factor V se puede abordar en el laboratorio clínico mediante pruebas rutinarias de hemostasia, como el tiempo de protrombina y el tiempo de tromboplastina parcial activada. Un aumento de estos dos parámetros indica una alteración en algún factor de la coagulación por lo que se debe proceder a determinar los niveles de factor V en relación a los datos de anamnesis y antecedentes familiares.

El tratamiento de las coagulopatías ha evolucionado muy rápidamente en las últimas décadas. Así, para la hemofilia A y B el avance en sus tratamientos ha sido más rápido y se dispone de factores exógenos comerciales de factor VIII o IX respectivamente. En el caso de otras coagulopatías ultra raras el avance en su tratamiento es mucho más lento y, por ejemplo, en el caso de la deficiencia de factor V, el tratamiento de elección es, en la actualidad, la utilización de plasma fresco congelado o el uso de concentrados de factores de la coagulación. En cualquier caso, ya sea la administración de concentrados de factores exógenos como de plasma fresco congelado, son tratamientos “paliativos” de los síntomas y nunca “curativos”.

Las terapias avanzadas como la terapia celular o la terapia génica representan las alternativas terapéuticas cuyo objetivo es curar una enfermedad desde su origen mutacional.

De forma muy simplista se puede definir la terapia génica como la transferencia, en una célula o células, de un fragmento de DNA que codifica para una proteína, y que puede curar una determinada enfermedad. Aunque los avances son importantes, todavía queda camino por recorrer en terapia génica para las coagulopatías congénitas, ya que la inmunogenicidad, la hepatotoxicidad del vector y los problemas derivados de su integración (mutagénesis insercional) son barreras importantes que hay que salvar. Otra alternativa a esta terapia génica de transferencia del gen terapéutico, es la corrección de los genes defectuosos y causantes de la patología en el paciente mediante la edición génica (corta y pega) como la denominada CRISPR/Cas9.

El término CRISPR (del inglés “Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeat”) es definido como repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas, que se asocian a endonucleasas denominadas proteínas Cas (del inglés “CRISPR-associated”). Se trata de una técnica muy precisa y efectiva que se viene utilizando en muchas enfermedades hereditarias y también en hemofilia A y B con buenos resultados.

Estas nuevas alternativas terapéuticas representan el paradigma de la nueva y futura farmacología individualizada, ya que no solo se personaliza el tratamiento una vez establecido en pauta general, sino que la individualización comienza con el propio diseño de la estrategia en función del propio paciente. Se tienen en cuenta sus características clínicas y el balance riesgo beneficio que deberá ser muy preciso, ya que habrá que considerar aspectos como la gravedad del fenotipo y la disponibilidad actual o no de un tratamiento paliativo eficaz.

La hipótesis de partida del proyecto presentado, plantea que algunas coagulopatías congénitas como el déficit de factor V de la coagulación, son enfermedades de origen mutacional monogénico, lo que hace que las terapias avanzadas, como la terapia génica, puedan ser una muy buena aproximación para futuros tratamientos “curativos” de estas enfermedades, mediante la corrección o bien la sustitución del gen defectuoso. Además, esta enfermedad en concreto no dispone de un tratamiento paliativo específico y eficaz.

De aquí, que el objetivo general haya sido desarrollar protocolos de terapia génica para este déficit, a través de objetivos específicos como la determinación de las mutaciones en el gen F5, el desarrollo de una estrategia de edición génica con CRISPR/Cas9 para la obtención de un modelo celular “knockout” in vitro con la mutación de la paciente a estudio, la corrección de esa mutación mediante la misma técnica de edición, y la comprobación de la funcionalidad coagulante del factor V producido.

Los estudios mutacionales y hematológicos se realizaron en dos pacientes (niña de Jaén y niña pakistaní) con déficit severo de factor V, y en sus progenitores; los estudios del modelo celular se llevaron a cabo con una línea celular HepG2 que produce factor V de forma constitutiva. En el caso de la paciente de Jaén se localizaron dos mutaciones diferentes, una en cada alelo, en el que la sustitución de un nucleótido por otro da lugar a un codon “stop” que produce una interrupción prematura de la síntesis de la proteína. Estas mutaciones dan lugar a un fenotipo patológico. Las mutaciones halladas en esta paciente fueron: NM_000130.4: c. 2218C>T, p.Arg740* y NM_000130.4: c. 3279G>A, p.Trp1093* (nueva mutación no descrita anteriormente), ambas en el exón 13 del gen F5. La madre de esta paciente presentaba la mutación c. 2218C>T, p.Arg740*, mientras que el padre presentaba la mutación c. 3279G>A, p.Trp1093*. En el caso de la paciente pakistaní, se localizó la misma mutación en ambos alelos que da lugar a la aparición de un codon “stop” produciendo la parada prematura de la síntesis de la proteína. Esta mutación da lugar a un fenotipo patológico. La mutación hallada, causante de esta patología, fue: NM_000130.4: c.2862del, p.Ser955Alafs*4, también localizada en el exón 13. Ambos progenitores de esta paciente eran portadores de esta mutación.

En cuanto a la segregación familiar, la madre de la paciente de Jaén es heterocigota para la mutación c. 2218C>T, p.Arg740*, con unos niveles de factor V en plasma del 63%, fenotipo leve sin sintomatología clínica reseñable. En el caso del padre, es heterocigoto para la mutación c. 3279G>A, p.Trp1093, con unos niveles de factor V del 21%, igualmente de fenotipo leve sin sintomatología clínica reseñable. En cuanto a los progenitores de la paciente pakistaní, ambos son heterocigotos para la misma mutación, c.2862del, p.Ser955Alafs*4, presentando unos niveles de factor V del 46%, sin sintomatología clínica apreciable.

El modelo celular se desarrolló con la mutación c. 3279G>A, p.Trp1093* de la paciente de Jaén y mediante edición génica con CRISPR/Cas9. Este modelo celular imitaba la misma situación patológica de la paciente. Mediante la misma técnica de CRISPR/Cas9 se corrigió la mutación en el modelo y se obtuvo factor V activo en coagulación.

Los protocolos de edición génica no comprometen la integridad y/o funcionalidad fisiológica de la célula editada, ya que no se encuentran alterados los parámetros evaluados entre una línea nativa y la editada. También es predecible por esta razón que este tipo de protocolos de edición puedan extrapolarse a estudios preclínicos en un modelo animal.

Las conclusiones de todo este trabajo desarrollado que tendrá continuidad en el tiempo para años venideros se pueden resumir en:

• Se ha observado una alta heterogeneidad mutacional en el gen F5, marcada por un alto factor de consanguinidad y una clara segregación familiar.
• La mutación c.3279G>A, p.Trp1093* encontrada en la paciente de Jaén, se trata de una nueva mutación, aún no descrita anteriormente, que da lugar a una proteína no funcional y a una deficiencia congénita severa de factor V.
• Tanto la mutación c.3279G>A, p.Trp1093* como la tecnología CRISPR/Cas9 desarrollada para tratar esta coagulopatía derivada de esta mutación, se han protegido mediante patente española con cobertura internacional.
• Las terapias avanzadas, en concreto la terapia génica basada en CRISPR, se alza como una alternativa real, eficiente y segura para su aplicación, en un “futuro cercano”, en enfermedades genéticas sin un tratamiento específico y curativo, haciendo realidad de manera muy veraz el ansiado término de “medicina personalizada”.
• La herramienta CRISPR nos permite desarrollar, con cierta facilidad, casi cualquier tipo de modelo de enfermedad, permitiéndonos estudiar la etiopatogénesis y los efectos clínicos. Además, nos ayudará a impulsar, en gran medida, el desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos específicos y eficaces.
• Se ha desarrollado en la línea HepG2, un modelo celular “knockout” deficiente en factor V, simulando de manera muy precisa la mutación de la paciente de Jaén en estudio, mediante edición génica con la herramienta CRISPR y la estrategia de “deleción precisa por unión de extremos no homólogos”. En este modelo de deleción, como cabía esperar, se encuentra bloqueada la síntesis de factor V funcional, como sucede en la paciente.
• Se ha establecido un procedimiento de corrección, basado en edición génica con CRISPR, para eliminar y revertir la mutación patológica, lo que hace restablecer la síntesis de factor V funcional con una eficacia del 41%. Este dato extrapolado a la clínica, en condiciones ideales hipotéticas, supondría casi la total reversión de los síntomas clínicos en los pacientes hasta un fenotipo muy leve.