RESUMEN:

La hemofilia A (HA) y hemofilia B (HB) son trastornos hemorrágicos recesivos ligados al cromosoma X y están causados por mutaciones en los genes F8 y F9, respectivamente, que dan lugar a la ausencia o disminución del factor VIII (FVIII) y el factor IX (FIX) de la coagulación. Actualmente, el diagnóstico molecular de las hemofilias comprende las técnicas de secuenciación directa como la secuenciación de Sanger o Next Generation Sequencing para la detección de variantes puntuales (SNV) y técnicas complementarias, como MLPA y long-range PCR, para identificar otro tipo de variantes como las inversiones, deleciones o duplicaciones. La identificación de los defectos genéticos en los individuos afectados es importante para el asesoramiento familiar y tiene un valor predictivo para la tendencia hemorrágica y el riesgo de inhibidores. Sin embargo, a pesar de las notables mejoras en las tecnologías para la identificación del defecto genético, todavía existen dos grandes retos no resueltos en el ámbito del diagnóstico molecular de la hemofilia: i) la identificación de la mutación en pacientes con hemofilia grave o moderada no resueltos genéticamente mediante las técnicas de rutina; ii) la caracterización completa de las variantes estructurales (SV) complejas.

Actualmente, existen tecnologías emergentes de análisis molecular avanzado, que eran poco accesibles hasta fechas recientes, como la secuenciación de tercera generación (TGS) que permite obtener lecturas largas que podrían resultar de gran utilidad para resolver los retos señalados más arriba. En este escenario, el objetivo del presente proyecto se centra en investigar en profundidad la base genética de los pacientes con hemofilia cuyo defecto molecular no ha sido identificado y, asimismo, caracterizar exhaustivamente las grandes SV identificadas en pacientes con hemofilia empleando la TGS basada en la tecnología de nanoporos. Después de dos décadas dedicadas al diagnóstico molecular de pacientes con hemofilia, en nuestro laboratorio se han identificado 8 pacientes con hemofilia grave sin mutación candidata y más de 25 pacientes con variantes estructurales que se incluyen en el presente proyecto. En concreto, el procedimiento propuesto para alcanzar los objetivos planteados se basa en enriquecer la región de interés del F8 y F9, según el caso, y la posterior secuenciación por TGS. Por este motivo, en primer lugar, se llevará a cabo una comparativa de dos estrategias distintas para enriquecer la región de interés: enriquecimiento mediante PCR o enriquecimiento computacional. A continuación, se empleará el protocolo definido para resolver la base genética de los pacientes seleccionados.

En definitiva, el presente proyecto pretende profundizar en las bases moleculares de la hemofilia, dilucidar los mecanismos patogénicos subyacentes a las SV y, en consecuencia, avanzar hacia una medicina personalizada que mejore la calidad asistencial ofrecida a estos pacientes y sus familiares, actualmente no completamente satisfactoria.